原核生物利用CRISPR-Cas抵抗在細(xì)胞上形成圖中結(jié)構(gòu)的病毒。 圖片來源：Tessa

　　它是個(gè)非常了不起的工具。我想知道這個(gè)系統(tǒng)從頭到尾如何工作。

　　Francisco Mojica并非第一個(gè)看見CRISPR的人，但他可能是第一個(gè)為它著迷的人。他還記得1992年當(dāng)他首次瞥見可能引發(fā)一場生物技術(shù)革命的這個(gè)微生物免疫系統(tǒng)的那一天。他在評估地中海嗜鹽菌的基因測序數(shù)據(jù)，注意到14個(gè)不尋常的DNA序列，每個(gè)有30個(gè)堿基。它們的前后讀數(shù)大致相同，每次重復(fù)35個(gè)堿基左右。很快，他看到更多的類似現(xiàn)象。Mojica由此踏入該領(lǐng)域，使重復(fù)序列研究成為他在西班牙阿利坎特大學(xué)集中研究的對象。

　　這并不是一個(gè)受歡迎的決定。他的實(shí)驗(yàn)室連續(xù)數(shù)年沒有收到資助。在會議上，Mojica會抓住機(jī)會逮住他能找到的任何大人物追問他們?nèi)绾慰创@種奇怪的小序列重復(fù)。“別太關(guān)注重復(fù)。”他們總是這樣警告他。“很多有機(jī)體中都有很多重復(fù)。我們知道它們已經(jīng)有幾年了，但并不知道它們中的大多數(shù)如何工作。”

　　今天，人們已經(jīng)了解到更多關(guān)于這個(gè)團(tuán)簇的信息，即定期中間短回文的重復(fù)序列，這使它獲得了CRISPR的名字，并幫助CRISPR-Cas微生物免疫系統(tǒng)毀滅入侵細(xì)菌。但是盡管生物醫(yī)藥領(lǐng)域大多數(shù)人已經(jīng)開始敬畏這一系統(tǒng)的運(yùn)行機(jī)制，尤其是一種叫作CRISPR-Cas9的版本，因?yàn)樗杀挥糜诰庉嫽颍琈ojica和其他微生物學(xué)家仍對該系統(tǒng)的一些基礎(chǔ)問題以及它如何運(yùn)行感到困惑。它如何演變？如何影響微生物演化？為什么一些微生物在使用它，而另一些則沒有？它是否在基礎(chǔ)生物學(xué)上擁有一些其他仍待了解的優(yōu)點(diǎn)？

　　它來自哪里？

　　諸如CRISPR-Cas的生物學(xué)優(yōu)勢非常明顯。原核生物（細(xì)菌以及鮮有人知道的被稱為古生菌的單細(xì)胞生物）面臨基因入侵者的不斷沖擊。病毒數(shù)量遠(yuǎn)超過原核生物，其數(shù)量比可達(dá)10:1，并且每過兩天就會殺死世界上一半的細(xì)菌。原核生物還會交換DNA的廢棄物：質(zhì)粒。它們可能是寄生的——通過使宿主的資源逐漸枯竭迫使其自殺，如果宿主在設(shè)法驅(qū)逐這個(gè)“搭便車”的分子。似乎沒有什么地方是安全的：從土壤到海洋到地球上最不宜居的荒涼地方，基因入侵者無處不在。

　　原核生物已經(jīng)進(jìn)化出大量武器來應(yīng)對這些威脅。但這些防御有些遲鈍。每個(gè)酶都經(jīng)過規(guī)劃以識別特定的序列，只有當(dāng)一個(gè)微生物獲得爭取的基因復(fù)本，它才可能得到保護(hù)。CRISPR-Cas更具活力。它能以類似于人類抗體在感染后提供長期免疫的方式適應(yīng)和記住具體的基因入侵者。“當(dāng)我們一開始聽到這種假設(shè)，我們認(rèn)為這種方式對于簡單的原核生物可能過于復(fù)雜了。”荷蘭瓦赫寧根大學(xué)微生物學(xué)家John van der Oost說。

　　Mojica和其他人在看到CRISPR回文重復(fù)之間的空間中的DNA有時(shí)和病毒基因組中的序列相匹配時(shí)，他們推斷了CRISPR-Cas的功能。從那時(shí)起，研究人員開始研制出與CRISPR相關(guān)聯(lián)的特定蛋白，并在細(xì)菌和古生菌接觸特定病毒或質(zhì)粒之后，將這些間隔的序列添加到基因組中。來自于那些間隔區(qū)的RNA會指導(dǎo)其他Cas蛋白吞掉任何與該序列相匹配的入侵DNA或RNA。

　　它如何工作？

　　近年來，很多關(guān)于Cas蛋白補(bǔ)充間隔區(qū)的分子細(xì)節(jié)已經(jīng)得到詳細(xì)了解，但病毒DNA在化學(xué)上近似于宿主DNA。在一個(gè)承載著DNA的細(xì)胞中，這些蛋白如何知道將哪個(gè)DNA添加到CRISPR-Cas記憶中？

　　這一賭注非常高：如果一個(gè)細(xì)菌添加了它本身DNA的一個(gè)片段，它會因?yàn)樽詣用庖哌M(jìn)攻而自殺。立陶宛維爾紐斯大學(xué)生化學(xué)家Virginijus Siksnys說，“這些酶是一把雙刃劍。”

　　可能是因?yàn)榧?xì)菌和古生菌種群能夠吸收一定錯(cuò)誤，美國北卡羅萊納大學(xué)微生物學(xué)家Rodolphe Barrangou說。如果其他細(xì)胞能夠在病毒攻擊之后蓬勃發(fā)展，一些細(xì)胞的自殺可能并不重要。

　　實(shí)際上，當(dāng)病毒潛入細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)時(shí)，通常1000萬個(gè)細(xì)菌中會有一個(gè)細(xì)菌獲得一個(gè)自我防御的間隔區(qū)。這一幾率使得研究是什么驅(qū)動間隔區(qū)識別非常困難，同時(shí)了解為什么其他細(xì)胞失敗之后另一個(gè)細(xì)胞會繼續(xù)下去也很困難。“當(dāng)它真正發(fā)生的時(shí)候，很難捕捉到那些細(xì)菌。”紐約洛克菲勒大學(xué)微生物學(xué)家Luciano Marraffini說。

　　它還可能做什么？

　　一些間隔區(qū)的起源是另一個(gè)謎題。到目前為止觀測到的低于3%的間隔區(qū)與DNA數(shù)據(jù)庫中任何已知的序列相匹配。

　　這反映了人們對病毒了解得多么少。大多數(shù)測序工作集中于那些感染者、牲畜或是莊稼。“我們對細(xì)菌的敵人知之甚少，特別是瘋狂的古生菌的敵人。”雅典佐治亞大學(xué)RNA生物學(xué)家Michael Terns說。

　　還有可能一些間隔區(qū)是已經(jīng)不存在或者變異到不可分辨的病毒的鬼魂。但第三種可能性也是熱門的研究領(lǐng)域。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas系統(tǒng)不僅是阻止基因入群者的案例。在一些細(xì)菌中，CRISPR-Cas成分會控制DNA修復(fù)、基因表達(dá)和生物膜的形成。它們還能決定一個(gè)細(xì)菌影響其他細(xì)菌的能力：嗜肺軍團(tuán)菌會導(dǎo)致退伍軍人病癥，它們一定擁有Cas蛋白Cas2，從而感染其天然宿主變形蟲。“一個(gè)主要的問題是有多少生物在防御之外。” 馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)家Erik Sontheimer說，“這是未來幾年若干只‘靴子’要落地的領(lǐng)域。”

　　為什么只有一些微生物會用它？

　　無論CRISPR-Cas有什么其他的功能，很明顯一些微生物使用它的幾率超過另一些。超過90%的古生菌具有基于CRIPSR的免疫，而經(jīng)過測序的細(xì)菌僅有1/3擁有它，Koonin說。并沒有非原核生物，甚至是單細(xì)胞生物，被發(fā)現(xiàn)存在CRISPR-Cas。

　　其中一種叫作納古菌的古生菌就像一種寄生蟲一樣，寄生在接近沸水中的另一種古生菌身上，并分發(fā)了很多與能量制作相關(guān)的基因和常規(guī)的細(xì)胞管家。然而，在其49萬DNA字母的說明書的小世界中，納古菌在CRIPSR-Cas系統(tǒng)上擁有約30個(gè)間隔區(qū)。“其一大部分基因組致力于CRISPR。”英國圣安德魯斯大學(xué)分子生物學(xué)家Malcolm White說，“CRISPR一定非常重要，然而我們并不知道其原因。”

　　這樣的不同表明有一些關(guān)鍵的生態(tài)因素支持CRISPR-Cas系統(tǒng)，更重視病毒防御或其他益處，而非細(xì)胞自殺的風(fēng)險(xiǎn)，?？巳卮髮W(xué)彭林校園微生物學(xué)家Edze Westra說。極端環(huán)境似乎會支持CRISPR-Cas系統(tǒng)，但Westra強(qiáng)調(diào)，類似系統(tǒng)的頻率在更適宜居住的棲息地的細(xì)菌中間也會呈現(xiàn)出一定變化。例如鳥類病原體——雞毒支原體在其宿主從雞轉(zhuǎn)變?yōu)橐叭笗r(shí)會丟掉其CRISPR-Cas裝備。然而，為什么該系統(tǒng)在雞身上有用，但在野雀身上無用，誰也說不清楚，Westra說。

　　存在多少種CRISPR-Cas類型？

　　研究人員已經(jīng)正式分辨出6種不同的CRISPR系統(tǒng)，包含19個(gè)亞種。“實(shí)際上我們只知道它們中一小部分在發(fā)揮作用。”Marraffini說。

       解開那些機(jī)制可能就會找到利用CRISPR-Cas系統(tǒng)的新生物技術(shù)。例如，備受科學(xué)家喜愛的CRISPR—Cas9屬于II 系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用轉(zhuǎn)錄自間隔區(qū)序列的RNA分子導(dǎo)向一種酶，切斷入侵病毒或DNA質(zhì)粒。

　　系統(tǒng)III是自然界最常見的CRISPR-Cas系統(tǒng)，也是了解最少的系統(tǒng)。到目前為止，證據(jù)表明它們不是對DNA或RNA自身作出回應(yīng)，而是對把DNA轉(zhuǎn)譯到RNA內(nèi)部的過程作出回應(yīng)。其他的系統(tǒng)可能也會突然出現(xiàn)，尤其是研究人員將他們的尋找目標(biāo)擴(kuò)展到培養(yǎng)皿之外時(shí)，包括了來自環(huán)境DNA樣本的基因測序。

　　對于Mojica來說，探索這種多樣性并回答關(guān)于CRISPR系統(tǒng)的基本問題比它們引發(fā)的革命更吸引人。“我知道它是個(gè)非常了不起的工具。它妙極了。它可以被用于治療疾病。”Mojica說，“但這不是我的事。我想知道這個(gè)系統(tǒng)從頭到尾如何工作。”（晉楠編譯）

(責(zé)編：魏艷、趙竹青)