生物學工具真正力量在于探索基因組運行方式

　　分子學家對CRISPR帶來的潛在新技術(shù)掀起新一輪探索。圖片來源：Ryan Snook

　　只要出現(xiàn)一篇關(guān)于CRISPR-Cas9的報道，Addgene的員工就會立刻找到它。這家非營利公司是論文作者經(jīng)常儲存研究中使用的分子工具的地方，也是其他科學家立即獲取這些分子工具的地方，還是一些科學家可以即刻得到相關(guān)試劑的地方。“一篇熱門論文發(fā)表之后，我們幾分鐘后就會接到電話。”這家美國馬薩諸塞州坎布里奇市的公司執(zhí)行主任Joanne Kamens說。

　　從2013年年初開始，Addgene公司接到的電話就不斷增多。當時研究人員報告稱利用CRISPR-Cas9技術(shù)，對所選位點人體細胞內(nèi)的基因組進行了切片。“正是那時發(fā)出了召集令。”Kamens說。從那時起，分子生物學家蜂擁著利用這種技術(shù)—— 一項可史無前例、輕而易舉地用于改變幾乎所有器官基因組的技術(shù)。Addgene目前已經(jīng)向83個國家的研究人員發(fā)送了6萬個與CRISPR相關(guān)的分子工具（占其總產(chǎn)品量的17%），2015年，該公司與CRFISPR相關(guān)的網(wǎng)頁閱覽次數(shù)超過1萬次。

　　目前，絕大多數(shù)關(guān)于CRISPR-Cas9的對話都是圍繞其治療疾病或編輯人類胚胎的潛力，但研究人員表示，真正的改革現(xiàn)在正在實驗室進行。CRISPR可以提供的以及生物學家所希望的都是“專一性”：在一個基因組的巨大范圍內(nèi)靶向以及研究特定DNA序列的能力。編輯DNA只是該技術(shù)的一個可用方面。科學家正在利用這些工具將蛋白精確地傳遞到DNA目標，以打開或關(guān)閉基因，甚至是對整個生物回路進行基因編輯，其長遠目標是了解細胞系統(tǒng)和疾病。

　　“對于分子生物學家來說，這的確是非常強有力地了解基因組如何工作的方法。”馬薩諸塞州波士頓兒童醫(yī)學血液專家Daniel Bauer說。“它的確提升了人們可解決問題的數(shù)量。”南加州大學分子生物學家Peggy Farnham補充說，“它蘊涵著無窮的樂趣。”

　　近日，《自然》撰文介紹了5種CRISPR-Cas9正在改變的生物學家編輯細胞的方法。

　　打破剪切

　　CRISPR-Cas9技術(shù)有兩個主要成分：一個是Cas9酶，可以像一把分子剪刀一樣剪切DNA；另一個是小RNA分子，將“剪刀”引向具體的DNA序列并進行剪切。細胞的固有DNA修復機器通常會修復剪切，但是經(jīng)常會發(fā)生錯誤。

　　盡管如此，這已經(jīng)給希望擾亂基因以了解其工作內(nèi)容的科學家?guī)砹烁＠；蚓幋a是無情的：修復中間發(fā)生的一個小小錯誤都會完全改變其編碼的蛋白序列，或是完全停止蛋白生產(chǎn)。因此，科學家可以在蛋白或基因擾亂時，研究細胞或有機體發(fā)生了什么。

　　但是還有一種不同的修復通道，有時也會根據(jù)DNA模板修復剪切。如果研究人員有了模板，那么他們就能夠在選擇的幾乎任何位點編輯幾乎任何想要的基因序列。

　　加州大學舊金山分校系統(tǒng)生物學家Jonathan Weissman團隊希望了解這種基因編輯工具在剪切人類DNA方面究竟表現(xiàn)如何，但他們打算采用一種不同的方法。“我們做的第一件事是：打破剪切。”Weissman說。該團隊用“死”Cas9嘗試了一些新方法。研究人員將其系在另一個蛋白的一部分上，該蛋白能夠激活基因表達。加了幾個其他扭曲，他們最終讓基因可以根據(jù)意愿打開及關(guān)閉。

　　此后，若干實驗室基于該方法發(fā)表了不同的研究成果。該方法也吸引了麻省理工學院合成生物學家Ron Weiss加入CRISPR的研究熱潮。該團隊在一次實驗中建立了多個基因扭曲，使其可以更快、更簡便地構(gòu)建復雜的生物學回路。“合成生物學最重要的目標是能夠通過這些精確的回路構(gòu)建復雜的行為。”Weiss說。

　　表觀遺傳

　　當遺傳學家Marianne Rots開始其職業(yè)生涯時，她希望發(fā)現(xiàn)新的醫(yī)療方法，通過基因療法靶向那些疾病變異基因。幾年后，在荷蘭格羅寧根大學醫(yī)學中心工作的她決定改變行動方向。她認為，控制基因活動的最佳方法是調(diào)整表觀基因組，而不是基因組本身。

　　表觀基因組是附加在DNA及DNA包裹蛋白化合物（即組蛋白）上的集合體。它們能夠控制DNA通路，打開或是關(guān)閉通向基因表達的蛋白。而這些標記會隨時間改變：隨著有機體發(fā)育及環(huán)境變化，它們會被添加或去除。

　　過去幾年，數(shù)百萬美元已被投入到這一領(lǐng)域，如計算不同人體細胞中的表觀遺傳標記以及與大腦活動和腫瘤生長相關(guān)聯(lián)的遺傳模式。但是由于沒有能力改變具體位點的標記，研究人員就不能決定它們是否會導致生物學變化。

　　CRISPR-Cas9將會扭轉(zhuǎn)局勢。2015年4月，北卡羅萊納州生物工程師Charles Gersbach和同事發(fā)表了一項技術(shù)，利用剪切將乙?；ㄒ环N表觀遺傳標記）添加到組蛋白上。

　　Rots曾利用相對較老的基因編輯工具鋅指酶蛋白探索表觀遺傳標記的功能，現(xiàn)在她在利用CRISPR-Cas9。“新工具讓這一領(lǐng)域變得民主化，而且已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛影響。”她說。Rots表示，人們以前經(jīng)常說，如果重新編寫表觀遺傳基因，并不會對基因表達造成影響，或者兩者之間的關(guān)系是巧合。“但是現(xiàn)在測試起來非常簡單，很多人都在加入這一領(lǐng)域。”她說。

　　代碼解密

　　DNA表觀遺傳標記并非唯一等待解開的基因代碼。超過98%的人類基因組均未指明蛋白質(zhì)遺傳密碼。研究人員認為，大量的DNA發(fā)揮著重要作用，所以他們正在利用CRISPR-Cas9了解代碼是什么。

　　RNA分子的一些編碼，如小分子RNA和小分子核糖核酸和長非編碼RNA，被認為與生產(chǎn)蛋白沒有關(guān)系，其他序列是在其指令下擴大基因表達的“增強子”。大多數(shù)與常見疾病風險相關(guān)的DNA序列位于包含非編碼RNA及增強子的基因組區(qū)域。但是在CRISPR技術(shù)之前，研究人員很難了解那些序列在做什么。“我們沒有好方法在功能上解釋非編碼基因組。”Bauer說，“現(xiàn)在，我們的實驗精巧多了。”

　　隨著研究人員利用CRISPR-Cas9技術(shù)探索越來越多的常規(guī)DNA，可能還會出現(xiàn)更多驚喜。然而，即便是利用CRISPR-Cas9，探索這一未知領(lǐng)域也存在挑戰(zhàn)。Cas9酶能在RNA向?qū)У闹敢录羟行枰庉嫷牡胤?，但這只能是當一種具體、常見的DNA序列位于剪切點附近時。這會給那些希望讓某個基因沉默的科學家?guī)硪稽c難題，因為關(guān)鍵的序列幾乎永遠存在于該基因內(nèi)部。研究人員正在探索細菌王國，尋找能夠識別不同序列的Cas9酶的“親族”。

　　去年，麻省理工學院和哈佛大學下屬博德研究院Feng Zhang實驗室發(fā)現(xiàn)，一個叫作Cpf1的酶的家族能夠擴展序列選擇。但是Agami強調(diào)，到目前為止所發(fā)現(xiàn)的像Cas9一樣用途廣泛的酶仍然非常少。未來，他希望能夠擁有整個系列的、可用于靶向基因組中任何位點的酶。“我們現(xiàn)在還沒有到達那里。”他說。

　　接觸光線

　　Gersbach實驗室正在利用基因編輯技術(shù)作為理解細胞命運以及如何操縱細胞的部分工具：該團隊希望未來有一天能夠在培養(yǎng)皿中培育出組織，用于藥物檢測和細胞療法。但是CRISPR-Cas9的作用是永久的，Gersbach團隊需要不時地打開或關(guān)閉基因，并且要在組織中非常具體的位點進行。“模擬血管需要高度的控制力。”他說。

　　Gersbach和同事選擇了不規(guī)則的編輯“剪刀”——現(xiàn)在能夠激活基因的Cas9，并加入了通過藍光激活的蛋白。當細胞接觸光線后，該系統(tǒng)能夠激發(fā)基因表達；但沒有光后，系統(tǒng)會停止基因表達。由日本東京大學生化學家Moritoshi Sato帶領(lǐng)的團隊研發(fā)了類似的系統(tǒng)，并且也可以在接觸到藍光后激活Cas9，實現(xiàn)基因編輯。

　　通過將CRISPR技術(shù)與化學“開關(guān)”相結(jié)合，其他人也得到了類似的結(jié)果。紐約威爾康乃爾醫(yī)學院癌癥遺傳學家Lukas Dow希望在成年大鼠體內(nèi)產(chǎn)生與癌癥變異相關(guān)的基因，從而復制出在人類結(jié)腸直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)的基因突變。該團隊利用CRISPR-Cas9技術(shù)，通過一個劑量的脫氧土霉素激活Cas9，從而使其切斷靶向目標。

　　疾病模型

　　從癌癥到神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域的研究人員正在通過CRISPR-Cas9技術(shù)創(chuàng)建疾病動物模型。這讓研究人員對更多動物、以更復雜的方式、在更大的范圍內(nèi)進行基因編輯。馬薩諸塞大學醫(yī)學院癌癥研究專家Wen Xue正在系統(tǒng)地選擇腫瘤基因數(shù)據(jù)，利用CRISPR-Cas9模擬培養(yǎng)皿以及動物體內(nèi)細胞生長過程中的突變。